引物设计tm值一般多少合适?(2)
发布时间： 2019-07-25
4、引物序列的GC含量一般为40-60%。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大；
5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；
6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
7、引物3'端不可修饰。引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。
8、引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加；
9、G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端 G值较低（绝对值不超过9），而5'端和中间 G值相对较高的引物。引物的3'端的 G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应；
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低，在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
阅读全文